试剂盒回收DNA片段回收率低的原因

英芮城品牌馆

2014-07-01点击量:

目前的回收试剂盒效果都很不错,可能不同的品牌的回收效率和纯度有点不同,但是大部分都能达到我们的要求。一般回收试剂盒的效率太低,可能有以下几个原因:

1. 电泳缓冲液pH值太高:硅胶膜在高盐及低pH值(pH7.5)时可结合DNA,在低盐及高pH值(pH8)条件下洗脱。如果电泳缓冲液pH值太高,会导致DNA无法结合或降低结合率。可在溶胶后加入 10μl KAcpH5.0),将pH值调至7.5以下。

2 回收的胶块太大(>400 mg):如果需要处理的胶块太大,应先将其切成小块,做两次回收或选用大量型回收试剂盒。

3. 胶块未全部溶解:溶解凝胶时应置于55水浴,不断上下颠倒,确定胶块完全溶解后再进行下一步骤。

4. 漂洗液中未加无水乙醇:次使用前应在漂洗液中加入无水乙醇。漂洗液每次用后应拧紧瓶盖,以免乙醇挥发,降低回收率。

5. 洗脱缓冲液不合适:DNA只在低盐溶液中才能被洗脱,如洗脱缓冲液EB (10 mM Tris·Cl, pH8.5)或水。洗脱效率取决于pH值。大洗脱效率在pH 7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内。

6. 洗脱缓冲液未加在离心柱中间尤其使用较少量洗脱缓冲液时,应加在离心柱正中间,并放置1-2分钟,再离心。

7. 加入异丙醇后产生雾状和凝胶状沉淀。这种现象可能是盐沉淀,颠倒混合样品沉淀就会消失。 或者是胶块没有完全溶解,此时可将混合物加入离心柱,离心,在离心柱中再加入0.5 ml 溶胶液室温放置1min,离心即可出去剩余琼脂糖凝胶。

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