基因枪活体植物基因转染

引言

本实验所用基因传递系统（基因枪）原理： 

       低压基因递送系统（GDS-80基因枪 U.S. Patent Number: 6,436,709 B1），根据火箭喷嘴原理和空气动力学原理设计，是用于传递生物微粒进入靶细胞的一种新型系统。如图1中所示，当左侧出现输入气体压力时（如：氦气），两个腔室之间将形成巨大的压力差，一旦该气体穿过装载样品的咽喉处，GDS-80中的气体输出将为生物粒子提供足够的动能量，使它们加速到接近超音速的速度（约300m/s）。在加速过程中，样品溶液会雾化并均匀地喷洒到靶向目标的表面上。
 

影响转染效率的因素

       在执行GDS-80轰击的同时，有四个主要因素影响转染效率。涉及火箭喷嘴设计原理方面，有两个：传递压力的设定和枪管的直径。通过增加输送压力的设定，可以使两个腔室中的压力差变大，从而增加生物微粒的速度，增加动能；而增大枪管直径会降低微粒的输出速度。传递距离也在实验中起到重要的作用，通过增加从枪管到目标样品的传递距离，生物颗粒将受空气阻力影响而减慢速度，不过这样也同时降低了损坏靶细胞的几率。后一个因素是传送样品的总量，被传送的样品量越大，越够能提高转染效率。 然而，调整输送距离和传递压力是几个因素中重要的，枪管大小和输送样品量应该保持在一个恒定数值，这样更容易修正实验。
 

活体植物实验

       针对植物细胞的基因组研究，现在已经通过使用很多不同的策略而被广泛开展。无论这些研究的主要目的是什么，这些研究成果终究是需要应用于活体植物的研究中来。将基因转染到活体植物方面之前存在很多障碍，比如如何维持无微生物的环境，如何保护植物本身组织的脆弱性，如何设定传递压力的大小，甚至是植物处于什么生长状况都是需要考虑的方面。通过使用GDS-80系统，Wealtec公司为基因转染活体植物这项实验提供了便捷的方法。

       通过调节传递压力和距离，GDS-80可将生物微粒成功转染到活体植物的植物细胞中。

材料:

• 烟草叶和藜属植物
• 低压基因递送系统：GDS-80 （Wealtec）
• 通用目标间隔器，UTS-10 （Wealtec）
• 质粒 DNA：以绿色荧光蛋白（GFP）报告性基因构建的病毒DNA。
• MaestroTM活体成像系统。 （CRI公司）

操作步骤：

1. 在进行实验前，至少培养样品30天，这样确能保叶片大于5×6 cm²。
2. 根据以下步骤制备DNA-金粉混合液：
  a. 将金粉微粒中加入充足的无菌蒸馏水。
  b. 使用100％乙醇对金粉微粒进行三次洗涤并弃去浮层。
  c. 加蒸馏水使金粉微粒重新悬浮。
  d. 将准备好的DNA溶液（1μg/μl）添加到金粉微粒溶液中，形成浓度为1μg DNA / 0.6mg金粉微粒悬浊液。
  e. 剧烈摇晃微离心管使得样品混合均匀。
  f. 滴入适当体积的0.1M亚精胺和2.5M CaCl2进入试管，同时不断剧烈地摇晃。
  g. 继续摇晃一分钟以上。
  h. 用100％EtOH进行三次洗涤，并弃去浮层。
  i. 重新使DNA包裹的金粒子悬浮于的EtOH中。
3. 按照说明书中要求的，讲UTS-10安装到GDS-80系统上，并设置40-50 psi的传递压力。 
4. 调整距离量尺至6-8 cm的传递距离。
5. 把四爪叶片夹夹到目标叶上，用手调螺栓将其拧紧固定。
6. 将等分10μl DNA混匀悬浊液倒入样品装载孔中。
7. 对叶片标本进行轰击。
8. 培育植株三天以上，通过使用CRi MaestroTM的体内成像系统观察荧光结果。

      
            （A）烟草植物叶片

      
            (B)藜属植物叶片

图2. 叶子被轰击后培育3天。通过使用CRi Maestro TM活体成像系统，左侧照片使用真彩色图像拍摄，右侧照片使用荧光感光拍摄。


     
           （C）烟草植物叶片

图3. 经过7天培育后，与被轰击过的叶子同属一颗烟草植株上的另一片叶子。通过使用CRi Maestro TM活体成像系统，左侧照片使用真彩色图像拍摄，右侧照片使用荧光感光拍摄。
 

讨论

       活体植物的性状特征和组织构成在不同植物间是有区别的。而在轰击活体植物过程中，有很多关于该特定种类植株的情况需要被考虑到，如植物所处生长阶段、植物大小、组织损伤，以及轰击部位。当传递生物微粒进入植物细胞时，操作者需要基于植物组织的性状而调节传递条件。在这篇文章中，藜叶的结构比烟草叶结构更复杂。当向藜叶传递时，好要缩短1-2 cm的传递距离或增加传递压力，以获得更好的结果。图2中，藜叶使用距离6 cm/50 psi传递，烟草叶通过UTS-10配件辅助使用距离8 cm/40 psi传递。 然而，在缩短与藜叶距离后，烟草叶子上的转染效率依然比较高。无论什么时候，组织都不应在轰击后而受到损伤导致枯萎，这是调节传递条件时应首先遵循的原则。

       经过7天的培养，由于DNA质粒中构建了具有GFP报告性基因的病毒DNA，因此GFP基因能够遍及整个植株表达和扩展。在图中3中可以看到，被轰击植株上的不同叶子，通过毛细管束被GFP基因感染。如果培养的时间周期较长，该基因可在整个植株中传递。

       通过调节压力和距离这两方面来控制传递条件是非常容易实现的。 GDS-80是一款非常强大的工具，尤其用来传递基因到活体植物中。通过UTS-10配件的辅助，无论是在体内还是在体外进行的实验，用户都可以更轻松地完成他们的植物靶向实验。

上一篇： 酶标仪运行原理

下一篇： 实时荧光定量PCR