一、提取和检测RNA实验比较方法
1.两种试剂盒平行提取同样样本的RNA;
2.检测提取物的RNA浓度(OD260)和纯度(OD260/280)
3.PCR检测RNA提取物的目标基因,
某公司用医脉赛的磁珠法石蜡包埋样本RNA提取试剂盒与国内某品牌的石蜡包埋样本RNA提取试剂盒(离心柱型)提取了6份病人石蜡包埋样本,用分光光度测定OD值检测RNA的浓度和纯度。样本提取物作了实时荧光pcr,根据样本的特征选择相应的目标基因,共获得14对pcr数据。OD值显示的RNA浓度,医脉赛仅为对照组的27%,而该RNA提取物的pcr结果表明,可扩增有效浓度医脉赛的为对照组的9倍。对照组虽然OD值显示提取浓度高,但扩增有效浓度低,提取样品RNA降解严重,或存在扩增抑制;医脉赛试剂盒提取的RNA去交联程度更高,有利于目标基因的扩增。
(1)从pcr结果分析RNA提取物的有效可扩增浓度
说明:Ct(达到阈值的扩增循环次数)能反映样本的有效浓度,Ct小者浓度高。
(2)比较二组的PCR的内参的Ct值,能得到二组的提取的RNA的pcr扩增的有效浓度比较值
【有效浓度(实验组)】/【有效浓度(对照组)】=2【Ct(对照组)-Ct(组)】
(3)比较二组PCR目标基因的⊿Ct,能推测二组对各目标基因的cr扩增的有效浓度比较
【有效浓度(实验组)】/【有效浓度(对照组)】=2【⊿Ct(对照组)-⊿Ct(实验组)】