本文将限制性内切酶在使用过程中常见的问题进行详细的分析，并给出解决建议。
一．DNA完全没有被内切酶切割
1) 内切酶失活 标准底物检测酶活性
2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子 将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3) 条件不适（试剂、温度） 检查反应系统是否佳
4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化 换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I） 换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
6) DNA位点上存在其它修饰 将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证
7) DNA不存在该酶识别顺序 换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
二. DNA切割不完全
1) 内切酶活性下降 用5-10倍量过量消化
2) 内切酶稀释不正确 用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
3) DNA不纯，反应条件不佳 同上
4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰 同上
5) 部分DNA溶液粘在管壁上 反应前离心数秒
6) 内切酶溶液粘度大，取样不准 将内切酶稀释，增大取样体积
7) 酶切后DNA粘末端退火 电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性 使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
9) 过度稀释使酶活性降低 适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
10)反应条件不适 使用佳反应体系
11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序 加大酶量5-10倍
三.DNA片段数目多于理伦值
1) 内切酶星状活性 检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量
2) 其它内切酶污染 用λDNA作底物检查酶切结果
3) 底物中含其它DNA杂质 电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段
四.酶切后没有观察到DNA片段的存在
1) DNA定量错误（如RNA含量较高） 用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀 在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次
五.内切酶保存期内快速失活
1) 保存温度不合适 内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
2) 以稀释形式保存 稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
3) 贮藏缓冲液不适当 使用厂家推荐的贮藏缓冲液
4) 低蛋白浓度 内切酶与500ug/ml的BSA一起保存
六.电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
1) DNA上结合有蛋白质 电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化
2) 内切酶中含有DNA外切酶 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
七.酶切后的DNA片段连接效率低
1) 含磷酸盐的浓度高 透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
2) 内切酶失活不全或含有ATP酶 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3) 平末端连接 加大T4 DNA Ligase用量
4) 外切酶污染 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
5) 连接缓冲液不合适 重新配制连接缓冲液
限制性内切酶 DNA 电泳
